Allium test

Шаблон:External mediaAllium test — растительная тест система для анализа мутагенных факторов химической и физической природы на основе растения Allium cepa (сорт Штутгартен). Allium-test — в котором в качестве материала используются корешки проростков репчатого лука Allium cepa, который впервые предложен Шведской Королевской Академией Наук как стандартный тест-объект.

---

Субстрат — вода или подготовленный раствор?

Средой для проращивания может служить:

• Вода из под крана:

• Очищенная, и отстоянная
• Пропущенная через фильтр типа «Кувшин»
• Пропущенная через систему тройной фильтрации

• Вода дистиллированная

• Необходимо знать характеристики дистиллятора, поскольку он способен вторично загрязнять чистую воду ионами металлов. Входящих в его конструкцию, например Медью

• Вода искусственная

• Уточнить у славы состав

Рекомендуется использовать искусственную воду и дистиллированную для контроля и дистиллированную воду для эксперимента.

Рассмотрим свойства различной по составу воды:

Дистиллированная	Солевой состав: отсутствует pH: сдвинут в сторону (введите значение) и составляет примерно (введите значение)Шаблон:Источник? Данная вода обладает мутагенным эффектом из-за отсутствия питательных веществ, необходимых для функционирования микроструктур клеткиШаблон:Источник?.
Искусственная	Солевой составШаблон:Источник?: Траляля pH: Находится у точки (введите значение)Шаблон:Источник? Данная вода определяется почти полным отсутствием видимых генетических нарушений. Необходимо проведение теста на CommetAssey для того чтобы убедиться что количество микронарушений так же мало

Неотсортирвоанные разделы, вы хотите удалить из них мусор?

Биотест Allium test разработан А. Леваном в 1938 году для изучения эффекта влияния W:колхицина, показав в итоге высокую эффективность. В настоящее время Allium-test используется наряду с постоянно увеличивающимся числом объектов (среди растений наиболее часто — горох Pisum sativum и бобы Vicia faba), но продолжает оставаться одним из наилучших тест-объектов для анализа генотоксичности и токсичности различных факторов.

Данный метод не требует знания кариотипа и идентификации типов повреждений хромосом, является простым, экономичным и достаточно чувствительным для определения «W:мутаген» или «не мутаген» фактор.

Allium test рекомендован экспертами ВОЗ как стандарт в цитогенетическом мониторинге окружающей среды, так как результаты, полученные на данном тесте, показывают корреляцию с тестами на других организмах: водорослях, растениях, насекомых, в том числе и млекопитающих и человеке. Рекомендован в качестве альтернативы in vivo тестам на лабораторных животных по токсикологическому критерию

Преимущества метода Allium cepa

Преимущества растительной тест-системы Allium cepa

Данный метод не требует знания кариотипа и идентификации типов повреждений хромосом, является простым, экономичным и достаточно чувствительным для определения «мутаген» или «не мутаген» фактор.

Метод позволяет регистрировать хромосомные мутации типа делеций и транслокаций, следствием которых является наличие мостов и фрагментов в ана- и телофазе. Кроме того метод позволяет выявлять изменение поведения хромосом на веретене деления.

Преимущества растительных тест систем на примере лука Allium cepa

Растительные тест-системы в настоящее время получают всё большее распространение при оценке мутагенного загрязнения окружающей среды. Это обусловлено целым рядом преимуществ растений как индикаторов генотоксичности различных факторов, так и сигнальных объектов при генетическом мониторинге за состоянием окружающей среды:

• Растения — неизменный объект для натурных исследований антропогенного влияния на окружающую среду: первыми принимают на себя удар загрязнителей, не мигрируют подобно животным, что позволяет чётко рассчитать время воздействия.
• Растения — эукариотические организмы, поэтому на них, в отличие от микроорганизмов, можно регистрировать все типы генетических повреждений:

• генные,
• хромосомные,
• геномные.

• Методы работы с растительными объектами экономичны, требуют минимального количества оборудования и W:реактивов, выращивание растений менее трудоёмко, чем выращивание животных.
• Можно получать материал нужных стадий.
• Эксперименты можно вести в строго контролируемых условиях — как в острых, так и в хронических опытах (от нескольких часов до нескольких лет).
• Данные по мутагенезу ряда факторов на растительных объектах показывают хорошую корреляцию с результатами тестирования на животных.
• Растения позволяют регистрировать как прямые, так и косвенные мутагены.
• Только растения позволяют выявить такой важный класс мутагенов, как W:химические соединения, приобретающие мутагенность в процессе метаболической активации растительными W:ферментами.
• Некоторые факторы, высокая токсичность которых не позволяет учесть генетические повреждения на животных, могут быть оценены как мутагены только в растительных тест-системах.
• Растения могут выращиваться непосредственно на месте оценки суммарного генетического эффекта загрязнения определяемых участков.
• Данные полученные на растительных тест-системах показывают хорошую корреляцию с данными тестов на млекопитающих. Более того, высшие растения проявляют себя в экосистеме как стабильный биосенсор и, таким образом позволяют отследить эволюцию генотоксического воздействия (в том случае когда фактор проявляет мутагенный эффект одновременно на растительном и животном тест объектах).

Методика проведения тестирования

Подготовка оборудования для тестирования

Химические реактивы

Ацетоорсеин	1 г орсеина растворяют в 50 мл горячей уксусной кислоты, доводят до кипения и фильтруют. Используется для окраски корешков
Фиксатор Кларка	смесь 96 % этилового спирта и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1. Используется для фиксации корешков.
Спирт 70 %	смесь 96 % этилового спирта и дистиллированной воды. Используется для долговременного хранения корешков
Уксусная кислота 40 %	смесь ледяной уксусной кислоты и дистиллированной воды. Используется для приготовления препаратов

Подготовка материала для тестирования

Подготовка луковиц

Выберите луковицы для исследования. Выборка должна быть однородной как в контрольном, так и в опытном вариантах опыта. Средняя масса севка — 10-20г, диаметром 1,5-2 см. Выбранные луковицы не должны быть пересушены. Это можно понять сняв лишнюю шелуху, которая так же может мешать и проведению опыта. До начала эксперимента у луковиц не должно быть проклюнувшихся зеленых ростков листьев.

Подготовка фактора мутагенеза и процедура тестирования

Существует два варианта Allium test: оригинальный и модифицированный.

• В оригинальном варианте теста луковицы помещают для проращивания корешков в чистую воду (прим: автор допускает использование водопроводной воды. Следует взять во внимание тот факт, что в Швеции, откуда родом автор водопроводная вода действительно очень чистая. Как вариант можно использовать очищенную питьевую воду низкой минерализации). По достижении корешками 1-2 см луковицы переносят в емкости с исследуемым раствором на определенное время (от 2 часов в случае с р-ом колхицина до 3 дней). Оригинальный вариант наиболее удобен при тестировании физических факторов.
• В модифицированном варианте теста луковицы помещают непосредственно в исследуемый раствор без предварительного проращивания корешков. Данный вариант чаще используется при тестировании химических веществ.

Для тестирования подходят факторы различной природы (см. таблицу):

Физический фактор:	Радиация (ионизирующее излучение) Ультрафиолетовое излучение W:Инфракрасное излучение: Температура Радиоизлучение (неионизирующее излучение): УВЧ излучение. В частности излучение GSM диапазона сотовых телефонов	В случае с физическим мутагенным фактором луковицы подвергаются воздействию фактора с прочими одинаковыми условиям среды, как в контроле
Химический фактор:	Различные химические соединения или W:растворы веществ. Allium test предложен для тестирования наночастиц, Фармацевтических и лекарственных препаратов Пестициды Природных и антропогенных сред: Природные воды Промышленные выбросы/сточные воды	В случае с химическим мутагенным фактором луковицы проращиваются на растворе или концентрированном растворе химического вещества и воды в заведомо определённой концентрации. Контроль проращивается на воде без добавления химического мутагенного фактора
Биологический фактор:	Продукты жизнедеятельности организмов Биотоксины (напр. охратоксин А продуцируемый некоторыми плесневыми грибами) Гормоны	Аналогично предыдущему

Для чистоты эксперимента допустимо использование дистиллированной воды. При этом луковица будет расти за счёт внутренних питательных резервов. Ограничение тут в том, что дистиллированная вода является мутагеном. Однако и в контроле, и в опыте в этом случае ущерб от дистиллированной воды будем считать равным, как и прочие фоновые условия.
Луковицы проращиваются от 3 до 4 дней. Желательно использовать емкости диаметром 1,5 см и высотой 10 см, чтобы по мере роста корни не упирались в дно ёмкости, в которой они находятся. Иначе это может приводить к некоторым биологическим эффектам — реакция меристемы на препятствие. Для проведения ана-телофазного анализа берут часть корешка длиной около 1 см. Проводят процедуру фиксации (для долговременного хранения). При необходимости корешки отмывают от фиксатора в воде, затем окрашивают ацеторсеином согласно стандартной методике. Для микроскопирования используют кончик корня длиной 1-2 мм — зона активного деления меристематических клеток.

Фиксация

Для фиксации корешки помещают в емкости с фиксатором Кларка (см.выше). Емкости герметично закрывают и оставляют для фиксации клеток на 1-2 дня. Затем материал промывают два раза от фиксатора в 70 % спирте, и помещают в емкости с 70 % спиртом для долговременного хранения. Спирт должен превосходить материал по объему в 4-5 раз.

Окрашивание материала

Окраску корешков производят 2 % ацетоорсеином (см. выше). Корешки отмывают от спирта в воде (удобно в чашках Петри). Материал переносят в небольшие фарфоровые тигли с держателем, которые на 2/3 заполняют красителем. Тигель накрывают предметным стеклом. Нагревают над пламенем спиртов до тайного кипения (запотевание покровного стекла). Тигель с материалом оставляют на некоторое время для прокрашивания хромосом (от 2 часов до 1 суток). После этого можно готовить препараты для микроскопирования.

Методика приготовления препаратов для микроскопического анализа

Готовят временные давленые препараты корневых меристем. Для этого от окрашенного корешка лезвием отрезают кончик меристемы длинной 2-3 мм (кончик отличается по более темной окраске и утолщением), помещают на предметное стекло в каплю 45 % уксусной кислоты, накрывают покровным стеклом и с помощью спички аккуратно раздавливают до получения монослоя клеток. Препараты анализируют под микроскопом при увеличении 12,5х1,5х40. На препаратах рассматривают мелкие, округло-квадратной формы клетки с хорошо прокрашенными ядрами и неповрежденными клеточными стенками.

Макроскопические исследования: скринниг-тест

Перед генетическим анализом следует провести первичный скриннинг-тест, который сразу покажет обладает ли фактор выраженной биологической активностью. Основным и наиболее важным изучаемым макропараметром является рост корней. Но помимо него могут еще изучаться другие параметры:

• Тургесценция. Твердость кончиков корней связана со степенью токсичности фактора. При высокой токсичности фактора тургесценция падает, что может привести к гибели корней.
• Изменение цвета. В течение эксперимента может меняться цвет корей и причина тому — содержание в воде определенных солей (например сине-зеленый от медного купопроса). Кроме того кончики корней могут стать коричневыми, что связанно с токсическим эффектом фактора, вызывающим клеточную смерть.

В качестве стандартных исследуются следующие параметры:

• Форма корней. Разбухание кончиков корней после 4-5 дней воздействия, свидетельствует об особом типе нарушения с-митозе. Изгиб корней или их кончиков происходит как правило после воздействия растворов определенных солей.
• Длина корней. Это значение средней длины корней (для 1 луковицы).

Методика измерения длины корней

Измерить длину корней можно двумя способами:

• Обычно длина корневой системы измеряется снаружи емкости с помощью рулетки (измерение для каждой луковицы). Этот метод позволяет проводить измерения в течение эксперимента.
• Более точным является второй способ. По окончании эксперимента корни срезаются у луковицы под основание, измеряется длина каждого корешка, вычисляется среднее значение (среднее значение для каждой луковицы). Поврежденные корни не учитываются. Затем устанавливается среднее значение длины корней для всей выборки луковиц.

Вычисление параметра корневого прироста

Рассчитывается средняя длина корней для каждой луковицы в опытных и контрольных сериях экспериментов. Затем вычисляется общее среднее значение длины для опытной серии и контрольной. Вычисляется во сколько раз длина корней в опытной серии больше/меньше чем в контрольной и выражается в процентах. Статистическую обработку результатов проводят с использованием дисперсионного анализа.

Изменение длины корней в Allium test-е является показателем токсичности. Это очень чувствительный показатель, который легко регистрируется визуально и не требует никаких специальных реактивов и аппаратуры, хорошо коррелирует с микроскопическими параметрами и потому предложен в качестве краткосрочного скриннинг-теста. Если происходит значительное угнетение роста корней по сравнению с контролем, то отмечают токсический эффект воздействующего фактора. В случае значительного прироста корней, говорят о стимулирующем эффекте.

Микроскопические исследования и статистическая обработка

Расчет частоты мутаций

В Allium test для расчета частоты мутаций традиционно применяется метод ана-телофазного анализа частоты хромосомных аберраций. На стадии ана- телофазы регистрируются мутации, связанные с грубым нарушением структуры хромосом, а так же с повреждением митотического веретена (веретена деления) или изменением поведения хромосом на веретене деления:

• отставания хромосом,
• аберрантные митозы:
  • трёхполюсные митозы,
  • четырёхполюсные митозы,
  • несимметричные митозы.

Рекомендации

При оценке мутагенной активности химических веществ достаточно использовать лишь W:ана-телофазный анализ, то есть регистрировать мутации в фазах митоза, так как меристемы в течение всего опыта находятся в контакте с воздействующим фактором. Но при изучении мутагенной активности ЭМИ этого оказалось недостаточно, поскольку воздействию излучения корневые меристемы подвергаются лишь некоторый период времени. В промежутках между облучениями происходит преобразование индуцированных в анафазе и телофазе хромосомных фрагментов — клетки выходят из митоза и переходят в интерфазу, а фрагменты становятся микроядрами. В результате эти мутации остаются неучтенными. В связи с этим была предложена модификация метода Allium test, которая позволяет учитывать всю сумму мутаций. На одном препарате было рекомендовано применять W:ана-телофазный анализ и микроядерный тест. При этом анализируется вся совокупность клеток (делящиеся и не делящиеся), что позволяет избежать ложноотрицательных ответов и дает более достоверные результаты.

Расчет митотического и фазных индексов

Расчёт митотических индексов можно проводить на тех же препаратах, что и W:ана-телофазный анализ. Просматривается от 400 до 600 клеток (больше — лучше). Подсчитывается общее количество делящихся клеток и отдельно клетки на разных стадиях W:митоза.

Обозначение фазы / индекса	Характеристика	Расчёт индекса
/ MI	митотический (mitotic) индекс (MI, %) W:Митотический индекс — процент делящихся клеток от общего числа проанализированных клеток.	$\text{MitoticI}=\frac{\text{(P+M+A+T)}}{\text{N}}*100\mathrm{\%}$ , где (P+M+A+T) — сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы, ана- и телофазы, а N — общее число проанализированных клеток.
П / ПИ	W:профаза (prophase) ПИ% — W:профазный индекс W:Профазный индекс — процент клеток в профазе W:митоза от общего числа проанализированных клеток	$\text{PI}=\frac{\text{P}}{\text{(P+M+A+T)}}*100\mathrm{\%}$ , где (P+M+A+T) — сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы, ана- и телофазы, а P — количество профаз в просчитанных клетках
М / МИ	W:метафаза (metaphase) МИ% — W:метафазный индекс W:Метафазный индекс — процент клеток в метафазе W:митоза от общего числа проанализированных клеток	$\text{MetaphaseI}=\frac{\text{M}}{\text{(P+M+A+T)}}*100\mathrm{\%}$ , где (P+M+A+T) — сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы, ана- и телофазы, а M — количество метафаз в просчитанных клетках
А / АИ	W:анафаза (anaphase) АИ% — анафазный индекс W:Анафазный индекс — процент клеток в анафазе W:митоза от общего числа проанализированных клеток	$\text{AI}=\frac{\text{(A)}}{\text{(P+M+A+T)}}*100\mathrm{\%}$ , где (P+M+A+T) — сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы, ана- и телофазы, а А — количество анафаз в просчитанных клетках
Т / ТИ	W:телофаза (telophase) ТИ% — телофазный индекс W:Телофазный индекс — процент клеток в телофазе W:митоза от общего числа проанализированных клеток	$\text{TI}=\frac{\text{(T)}}{\text{(P+M+A+T)}}*100\mathrm{\%}$ , где (P+M+A+T) — сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы, ана- и телофазы, а Т — количество телофаз в просчитанных клетках
А-Т / А-ТИ	ана- телофаза А-ТИ% — ана- телофазный индекс Ана- телофазный индекс — процент клеток в анафазе и телофазе W:митоза от общего числа проанализированных клеток	$\text{A-TI}=\frac{\text{(A+T)}}{\text{(P+M+A+T)}}*100\mathrm{\%}$ , где (P+M+A+T) — сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы, ана- и телофазы, а А+Т — количество ана- и телофаз в просчитанных клетках

Статистическая обработка данных

Проводиться с использованием математических пакетов (Statistica, MS Excel). Для статистического анализа данных, полученных методом Allium test (частота хромосомных аберраций и микроядер, фазных индексов и т. д.) была разработана самовычисляющая электронная таблица на основе MS Excel. Она дает возможность эффективно группировать данные на листе, предоставляет выходные данные в удобном для обработки и использования виде, а так же позволяет в будущем наращивать функционал таблицы.

См. также

• Ана-телофазный анализ

• Allim test

• Митотический индекс
• Хромосомные перестройки

Источники информации

Литература

Шаблон:Статья
Шаблон:Статья